目前，七叶一枝花主要来自于野生资源，但其根茎生长十分缓慢，逐年大量采挖使野生七叶一枝花资源面临枯竭的危险，人工栽培已经势在必行。七叶一枝花的人工繁育包括根茎繁育和种子繁育，其中种子繁育具有繁殖系数大、生产成本低等优点，但也存在休眠水平高、自然萌发率低、 “二次发育”等生理后熟现象。
因此，人工打破种子休眠期、缩短种子的萌发周期并提高发芽率是实现利用种子大量繁育七叶一枝花的关键。
一氧化氮（NO）在种子的萌发过程中起重要作用，其常用的供体为硝普钠（sodium nitroprusside，SNP）。SNP分子中的亚硝基基团在植物体内半胱氨酸、谷胱甘肽或其他2SH类化合物的存在作用下，或通过细胞色素P450/NADPH系统的催化，会逐步分解释放出NO。
有研究表明，外源SNP处理后能显著提高黄连种子的发芽率及其活性。章玉平等研究发现SNP处理对凤仙花、千日红、孔雀草的萌发有调控作用，还有黑麦的种子在SNP处理的情况下，其萌发进程也显著缩短[10]。
然而，NO对七叶一枝花等重楼属植物种子的萌发影响鲜见报道。因此，笔者通过对不同浓度的SNP溶液（50～150 μmol/L）处理下种子的萌发情况进行观察，并在此基础上分析最适SNP浓度处理后七叶一枝花种子萌发过程中NO含量、淀粉、可溶性糖、可溶性蛋白以及α、β、总淀粉酶的活力变化，探索外源NO对七叶一枝花种子萌发的生理生化影响，为实现人工快繁和深入研究重楼种子萌发的内在机制提供参考。
1材料与方法
1.1材料所用材料为2016年秋季采集于武陵山区试验田的3年生七叶一枝花的成熟种子。种子采收后，去除颖壳和外种皮，室温晾干后装入透气袋，置于4 ℃冰箱处理备用。
1.2浸种处理 挑选籽粒健康、饱满的七叶一枝花种子，先用清水泡2 d，使种子吸涨发白，然后将处理后的种子分别置于不同浓度的SNP溶液（50、80、100、120、150 μmol/L），以清水处理作为对照组。此外为了考察SNP的促萌效果，还增加了黄珍等研究发现的促萌效果较好的GA3（500 mg/L）溶液也作为参照。所有种子置于25 ℃恒温条件下浸种48 h。
1.3萌发培养浸种结束后，分别将各处理组的种子先用清水洗5遍，然后用75%乙醇消毒30～40 s，无菌水冲洗后再用0.1%的升汞消毒10～12 min，最后用无菌水冲洗干净。随后将种子转移至铺有3层无菌滤纸的培养皿中进行暗培养，每皿150粒，每个处理重复3次，培养温度（19±2） ℃，湿度70%。
1.4取样培养期间定时补充水分以确保种子处于湿润状态，并分别于培养的第0、15、30、45、60、75、90天观察种子的萌发形态、统计萌发率，同时分别取样150粒，贮存于-80 ℃冰箱用于生理生化指标的测定。
1.5生理指标测定该研究用的试剂盒有植物淀粉含量试剂盒、植物可溶性糖含量试剂盒、植物淀粉酶含量试剂盒、植物NO含量试剂盒、植物可溶性蛋白含量試剂盒，均采购于苏州科铭生物技术有限公司，分别用以测定重楼种子内淀粉含量、可溶性糖含量、α 淀粉酶和 β 淀粉酶活力、NO含量以及可溶性蛋白含量。所有步骤均按说明书进行操作。不同萌发阶段的各个生理生化指标重复测定3次。
1.6数据统计及分析利用Microsoft Excel 2010、Sigma Stat等软件进行数据统计、作图和分析。
2结果与分析
2.1不同浓度SNP处理下种子的萌发状态
由图1可知， 100 μmol/L SNP处理的七叶一枝花种子萌发速度最快。萌 发培养的第30天已有胚根突破种皮，比CK（清水处理）的萌 发时间（第60天）要早30 d左右，同时比500 mg/L GA3处理 组（第45天萌发）也提前了15 d左右。种子萌发培养的第45天开始，随着培养时间的延长，尽管其他处理组的种子也陆续有萌发现象，但是100 μmol/L SNP处理条件下，其胚根的生长状况明显优于其他试验组。
2.2不同浓度SNP处理下种子的萌发率
从表1可以看出，100 μmol/L SNP溶液处理下，萌发培养的第30天，七叶一枝花种子的萌发率为3.67%，其余处理组均为0。第45天开始，500 mg/L GA3、80和120 μmol/L SNP 3个处理组中，也有种子开始萌发，但其萌发率均低于7.00%，而100 μmol/L SNP处理组中，其萌发率高达15.00%，显著高于CK（0）和500 mg/LGA3（6.67%） 处理组。萌发第60天，100 μmol/L SNP处理组中，已经有超过50%的种子萌发；萌发第75天时，100 μmol/L SNP处理组的种子萌发率已经达到90.00%，远远高于其他试验组。
此外，80和120 μmol/L SNP处理后的种子萌发时间早于CK，且同时期120 μmol/L SNP处理组种子的萌发率高于CK；80 μmol/L SNP处理组种子只在75 d的萌发率略低于CK，其他时间内，其萌发率均高于对照组。表明80和120 μmol/L SNP对七叶一枝花种子的萌发也具有一定的促进作用。而50和150 μmol/L SNP处理组中，不同时期种子萌发率均低于CK，表明外源NO浓度过高或者过低均抑制七叶一枝花种子的萌发。
结合图1和表1的结果可知，100 μmol/L SNP溶液处理后，对七叶一枝花种子的萌发促进效果好，因此该研究后续试验中主要探讨了100 μmol/L SNP处理组中相关生理指标的变化。
2.3NO含量的变化从图2可看出，SNP组中NO含量随着种子萌发率的提高而逐渐增高，在第45天时达到峰值（0.318 μmol/g），随后NO的含量呈现逐渐降低的趋势，直到第90天。对照组中NO含量变化趋势与SNP处理组类似，都有先升高后降低的趋势。与对照相比，SNP处理组的NO含量在整个萌发期间基本上都高于对照，其中种子萌发的45～90 d，NO含量均显著或极显著高于对照组。
2.4可溶性糖的含量变化由图3可知，SNP处理组中，种子内的可溶性糖含量在萌发的第15天显著升高，随后趋于平稳的变化趋势，而CK组中种子的可溶性糖水平直到第60天才出现显著升高的趋势，其最大值出现在萌发的第90天（209.119 mg/g）。萌发前期（第15～45天），SNP处理组中种子的可溶性糖含量显著或极显著高于对照组。
2.5淀粉含量的变化由图4可知，100 μmol/L SNP处理组的种子在萌发第0～45天，其淀粉含量迅速下降，而同时期的对照组种子中淀粉含量显著或极显著高于处理组。萌 发培养的第60～90天， SNP处理组种子的淀粉含量不再呈下降趋势，其含量水平趋于平稳。对照组中，淀粉含量在萌发的第60天开始迅速下降，萌发培养的后期SNP处理组与对照组的淀粉含量无显著差异。
2.6淀粉酶活力的变化由图5可知，整个萌发期间α淀粉酶活力变化中，除了萌发第30天和第60天对照组的淀粉酶活力和100 μmol/L SNP处理组差异显著外，其余各时期中，对照组和处理组的α淀粉酶活力差别都不明显。100 μmol/L SNP处理组的β淀粉酶活力，在萌发前期（0～30 d）显著高于对照组，随后略有下降，处理组内不同时期的β淀粉酶整体变化趋势不大；对照组中的β淀粉酶则呈现出前期变化不大（0～30 d），后期（45～90 d）逐渐升高的趋势，并且在萌发的第60～90天其含量显著高于SNP处理组。100 μmol/L SNP处理组的总淀粉酶活力，在萌发前期（0～30 d）显著高于对照组，随后略有下降，但是整体变化的趋势不明显；对照组中的总淀粉酶则呈现前期变化不大（0～30 d），后期（45～90 d）逐渐升高的趋势，并且在萌发的第60～90天其含量显著高于SNP处理组。由图5b和图5c对比观察得知，β淀粉酶的变化趋势与总淀粉酶的变化趋势类似。
2.7可溶性蛋白含量的变化由图6可知，SNP处理后，种子在萌发过程中可溶性蛋白含量随着处理时间的延长而下降，其中较高值出现在第0天（58.043 mg/g），第15天含量迅速降低，而第15～90天可溶性蛋白含量变化较平稳。对照组的种子可溶性蛋白含量变化趋势与SNP处理组类似，较高值也出现在第0 天（60.392 mg/g），第15～90天变化较为平稳。在整个萌发期间，SNP处理组和对照组的可溶性蛋白含量差异不明显。
3结论与讨论
一氧化氮是植物体内广泛存在的内源调节分子，目前人们已经发现它对植物呼吸作用、光形态建成、种子萌发、根和叶片的生长发育、气孔运动各种胁迫的响应以及预防反应等生理过程都有一定的作用。该研究表明，不同浓度（50～150 μmol/L）SNP对七叶一枝花种子的萌发产生了不同的影响，其中100 μmol/L SNP溶液处理后，可以显著提高七叶一枝花种子的萌发率，缩短七叶一枝花种子的发芽周期，而浓度过高（150 μmol
/L）或过低（50 μmol/L）的SNP则降低七叶一枝花种子的萌发率。
该研究表明，SNP处理组种子在第45～90天种子快速萌发阶段，处理组的NO含量迅速升高且显著高于对照组，暗示着外源NO处理后，可以显著增加种子内的NO含量，而种子内源NO含量的升高，是否会使得种子萌发的抑制物质如ABA激素等的含量降低，从而使得种子萌发率升高，有待进一步深入研究。
种子萌发过程中，淀粉在淀粉酶的作用下分解为小分子糖，为萌发提供营养。淀粉酶主要包括α淀粉酶和β淀粉酶，其中α淀粉酶能够将淀粉降解成约6个葡萄糖单位的还原性糊精，然后再分解为麦芽糖和葡萄糖。而β淀粉酶可使淀粉转化为麦芽糖。该研究表明，SNP处理组和对照组种子内α淀粉酶在整个萌发期差异不大，而处理组的β淀粉酶在種子萌发前期（第0～30天）显著高于对照组，后期（第60～90天）变化平稳，而对照组的β淀粉酶则在萌发后期（第60～90天）才逐渐升高；总淀粉酶的变化趋势与β淀粉酶的变化趋势类似。该研究结果暗示，β淀粉酶能快速地响应外源NO的诱导，而α淀粉酶则不受外源NO的诱导，这与小麦中的研究结果相似。此外，该研究结果发现，种子内β淀粉酶的显著升高和各自淀粉含量的降低以及种子开始萌发的时间节点密切吻合，暗示该酶活性的升高是淀粉水解和促进萌发的一个关键因素。
该研究还发现SNP处理后，七叶一枝花种子的可溶性糖含量总体上高于对照，并且在第15～45天差异达到显著水平，表明SNP在种子萌发初期加速了淀粉分解为可溶性糖的速率，为种子的快速萌发提供可利用的营养物质。随着种子的萌发，以及胚乳中的淀粉被不断分解，可溶性糖的含量不再显著增加，其变化较小；此外胚根突破种皮后，可溶性糖的增长速率变缓慢，这可能是由于在种子进入萌发阶段后，种子的呼吸作用增强，利用可溶性糖的速率增加。与此相对应的是，SNP处理后种子萌发早期（0～45 d）淀粉的含量也显著低于对照组，而对照组的淀粉分解的速率是在45 d以后才大幅度增加，此过程表明外源NO处理，可以在种子萌发期间通过提高种子胚乳内β淀粉酶的活性促使淀粉水解为麦芽糖等可溶性糖而促进种子的萌发。
该试验中，种子可溶性蛋白含量测定的研究结果表明，SNP处理组和对照组中可溶性蛋白含量均为逐渐降低的趋势，但是不同处理组间差异都不明显，这与莴苣种子萌发过程后，SNP处理后可溶性蛋白的变化趋势类似。该结果暗示，尽管淀粉酶类的可溶性蛋白在不同处理组之间有显著变化，但是总的可溶性蛋白并未受到SNP的影响。种子萌发过程中涉及到的一系列生理活动，包括呼吸加强、营养物质动员、贮藏mRNA的利用等，无一例外的涉及到大量相关蛋白质的调动和功能执行。因此，SNP处理后促进种子萌发的过程中，还有哪些蛋白受到诱导或调控，有待于进一步研究。
